Description du sujet de thèse

Le monitoring de paramètres biologiques in-situ est au cœur des nouveaux défis de l'observation augmentée des eaux côtières que ce soit pour répondre à des problématiques de biosurveillance de pathogènes, de monitoring de la diversité ou encore pour le suivi de taxons spécifiques. Il n'est à l'heure actuelle possible que par des techniques de prélèvement puis analyses en laboratoire basées sur la culture qui requièrent plusieurs jours avant l'établissement du diagnostic de contamination, ce qui rend impossible le suivi à haute résolution spatiale et temporelle, mais aussi de recourir à toute stratégie d'atténuation en temps réel. Elles ne permettent pas non plus de détecter les cellules présentes dans un état viable mais non cultivable induit par les changements environnementaux (1, 2, 3). Ainsi dans un scenario idéal et pour soutenir la biosurveillance augmentée des eaux côtières, les données environnementales et bactériologiques devraient être collectées, analysées, interprétées et communiquées à distance en temps quasi réel afin de détecter ou mieux encore de prédire la présence d'agents pathogènes. Nous proposons une approche pluridisciplinaire visant à développer un instrument de mesure pour le suivi in-situ en continu des abondances de taxons bactériens spécifiques à l'aide d'un biocapteur automatisé. Ce capteur actuellement à l'étude en laboratoire permet de détecter des marqueurs moléculaires associant activité́ cellulaire et information taxinomique.
Ce projet s'appuie sur deux piliers fondamentaux :
i. Une procédure moléculaire d'identification génétique d'un taxon bactérien dans l'environnement mettant en œuvre trois étapes : 1) étape pré-analytique : prélèvement de l'eau, concentration et lyse cellulaire ; 2) étape analytique : reconnaissance de la cible moléculaire par hybridation type sandwich couplée à un essai immunologique et 3) Détection de signal par colorimétrie. Cette procédure sera évaluée sur deux modèles bactériens, d'une part les membres appartenant au genre Vibrio spp. regroupant une grande diversité d'espèces pathogènes pour l'homme et la faune marine et d'autre part l'espèce Escherichia coli, espèce indicatrice, règlementée, témoin de pollution fécale.
ii. Le développement d'une plateforme microfluidique automatisée munie d'un nouveau type de dispenseur permettant la délivrance de micro-volumes calibrés de plusieurs réactifs de façon parallèle à l'aide d'un seul actionneur électromécanique, couplé à une micro pompe piézoélectrique à membrane permettant l'implémentation d'un système analytique automatisé de type FIA (Flow Injection Analysis), l'intégration de micromélangeurs 3D, et une cellule de mesure d'absorption munie d'un détecteur multispectral low-cost permettant de faire des mesures.
L'association de ces deux piliers permet d'envisager la réalisation d'un instrument de mesure déployable in-situ dans la colonne d'eau pour un suivi continu de taxons bactériens d'intérêt, avec un coût de revient faible et une facilité de réplication de par les technologies employées. De par son caractère relativement générique, le développement de cette plateforme microfluidique pourra être décliné, moyennant adaptation, à un grand nombre de méthodes colorimétriques et/ou de bioluminescence, permettant d'adresser un large spectre de paramètres (nutriments, pH, ATP …).

Objectifs
L'objectif principal de la thèse sera de développer et mettre au point la plateforme d'analyse pour démontrer sur le terrain la possibilité de réaliser un suivi continu de la présence de bactéries spécifiques dans les eaux côtières. Les questions scientifiques se situeront à la fois au niveau du transfert de la méthode d'identification moléculaire dans des micro-volumes, et dans la réalisation technologique d'une plateforme microfluidique capable d'implémenter l'ensemble des étapes analytiques nécessaires de façon automatisée et répétable. La thèse impliquera de facto une collaboration très étroite des deux laboratoires d'accueil, afin de croiser les contraintes issues de la méthode colorimétrique retenue, et les contraintes technologiques liées au système microfluidique.

Contexte de travail

La thèse se déroulera au Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes (LAAS) à Toulouse, avec des missions régulières au Laboratoire de Biodiversité et Biotechnologies Microbiennes (LBBM) à Banyuls-sur-Mer. Des solutions d'hébergement pour Banyuls seront mises à disposition du·de la candidat·e. Il·elle pourra s'appuyer sur l'expertise et les moyens technologiques et humains du LAAS, via ses plateformes de Micro-nanotechnologie, de Caractérisation et de fabrication additive MultiFAB, sur l'expertise et les plateformes expérimentales en microbiologie et (bio)chimie environnementale du LBBM, via les plateformes de biologie moléculaire BIO2MAR et de cytométrie BIOPIC, ainsi que sur les moyens d'observation et d'expérimentation in-situ de l'Observatoire Océanologique sur Mer (BOSS, ReMiMed). Le financement de la thèse est acquis, et le projet s'appuiera sur des moyens financiers supplémentaires déjà acquis, notamment via l'Equipex+ Terra Forma.

https://www.laas.fr/public/fr/plates-formes
https://www.laas.fr/projects/MultiFAB/
https://www.obs-banyuls.fr/fr/observer.html
https://www.obs-banyuls.fr/fr/observer/remimed.html
https://terra-forma.cnrs.fr/

Le poste se situe dans un secteur relevant de la protection du potentiel scientifique et technique (PPST), et nécessite donc, conformément à la réglementation, que votre arrivée soit autorisée par l'autorité compétente du MESR.

Contraintes et risques

La thématique de recherche étant à l'interface de la microfluidique et la biologie marine et moléculaire, le·la candidat·e devra démontrer une curiosité scientifique, un goût pour les approches pluridisciplinaires, et être motivé·e par ce sujet à fort enjeu sociétal. L'étudiant·e devra posséder des connaissances en microfluidique avec une ouverture sur les applications en biologie marine et moléculaire ou vice et versa.

Informations complémentaires

Nature de la Bourse :
Groupe de Recherche OMER (Océans et MERs), axe Caractérisation et diagnostics des systèmes marins, Groupes de travail « Océan numérique » et « Nouveaux outils d'Observation de l'Océan »

Encadrement :
Vincent Raimbault (LAAS) - vincent.raimbault@laas.fr
Julia Baudart (LBBM) - baudart@obs-banyuls.fr

Références :
1. Oliver J. D. (2010). FEMS Microbiol. Rev. 34, 415–425. doi: 10.1111/j.1574-6976.2009.00200.x
2. Girard L., Peuchet S., Servais P, Henry A., Charni-Ben-Tabassi N, Baudart J. 2017. Spatiotemporal dynamics of total viable Vibrio spp. in NW Mediterranean coastal area. Microbes Environ. 32 (3) 210-218. doi: 10.1264: jsme2.ME17028.
3. Schauer S, Jakwerth S, Bliem R, Baudart J, Lebaron P, Huhulescu S, Kundi M, Herzig A, Farnleitner AH, Sommer R, Kirschner A. (2015). Dynamics of Vibrio cholerae abundance in Austrian saline lakes, assessed with quantitative solid-phase cytometry. Environ Microbiol. 17(11):4366-78. doi: 10.1111/1462-2920.12861.
4. Paniel N., and Baudart J. (2013). Colorimetric and electrochemical genosensors for the detection of Escherichia coli DNA without amplification in seawater. Talanta. 115: 133-142.
5. Da-Silva E, Barthelmebs L., Baudart J. (2017). Development of a PCR-free DNA-Based assay for the specific detection of Vibrio species in environmental samples by targeting the 16S rRNA.Environmental Science and Pollution Research. 24(6):5690-5700. doi: 10.1007/s11356-016-8193-9.
6. Accardo A, Courson R, Riesco R, Raimbault V, and Malaquin L. (2018) Direct laser fabrication of meso-scale 2D and 3D architectures with micrometric feature resolution. Additive Manufacturing, 22:440 – 446, doi: 10.1016/j.addma.2018.04.027. URL https://hal.laas.fr/hal- 01875364
7. Lace, A, Byrne, A, Bluett, S, Malaquin, L, Raimbault, V, Courson, R, Hayat, Z, Moore, B, Murray, E. (2022) Ion chromatograph with three-dimensional printed absorbance detector for indirect ultraviolet absorbance detection of phosphate in effluent and natural waters. J Sep Sci. 45: 1042– 1050. https://doi.org/10.1002/jssc.202100897
8. Sanchez, R.; Groc, M.; Vuillemin, R.; Pujo-Pay, M.; Raimbault, V. Development of a Frugal, In Situ Sensor Implementing a Ratiometric Method for Continuous Monitoring of Turbidity in Natural Waters. (2023) Sensors, 23, 1897. https://doi.org/10.3390/s23041897