Description du sujet de thèse

Sujet : Caractérisation structurale par RMN de l’alpha-synucléine dans des organoïdes cérébraux.
Domaine scientifique : biologie structurale, RMN in-cell, maladies neurodégénératives
Résumé: Nous appliquerons les méthodes de RMN in-cell (établies par l’encadrant) à des organoïdes. Elles reposent sur l’intégration d’acides aminés 13C/15N pendant l’expression de la protéine d’intérêt, qui permet l’observation spécifique de celle-ci par RMN à l’échelle du résidu. Nous étudierons l’alpha-synucléine (maladie de Parkinson), objet d’étude récurrent de l’encadrant. Ces méthodes seront ensuite applicables à des cibles pharmacologiques plus habituelles (kinases).
Contexte scientifique : Nous proposons d'établir la détection résidu-spécifique par RMN de l’alpha-synucléine (aSyn) dans des organoïdes cérébraux, et d'en illustrer les premières applications. L’aSyn est retrouvée agrégée chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Nous ne comprenons pas précisément les événements conduisant à cette agrégation corrélée à des défauts neuronaux. Une profusion d'informations existe sur l’aSyn et ses partenaires à haute résolution sur des protéines purifiées, et à plus basse résolution dans des cellules/animaux, donnant un aperçu précieux mais encore insuffisant de leurs structures (patho)physiologiques et de leurs rôles en conditions saines et pathologiques. La «RMN in-cell» peut relier les spectroscopies/microscopies standards, en fournissant des informations résidu-spécifique sur les structures, dynamiques et interactions des protéines dans les cellules. Nous l‘étendrons à un modèle avancé du cerveau humain, i.e. les organoïdes cérébraux.
Objectifs: La "RMN dans les organoïdes" sera non destructive et permettra de mieux cerner les événements moléculaires précoces des maladies amyloïdes. Nous i) produirons des organoïdes génétiquement manipulées pour permettre l'expression inductible de l’aSyn, ii) induirons la production d’aSyn en présence d’acides aminés 13C/15N, iii) détecterons la 13C/15N-aSyn dans ces organoïdes grâce à un filtre RMN 13C/15N. Cela permettra un suivi RMN longitudinal de la structure et des interactions de l’aSyn dans des conditions variables (ici : stress oxydatif ou suppression des chaperons), en parallèle avec l’analyse 3D par microscopie de fluorescence à feuillets de lumière. Le consortium (FX. Theillet-CiTCoM, F. Yates-Supbiotech) a déjà établi de tels schémas expérimentaux, avec des cellules adhérentes pour la RMN in-cell, ou en exprimant des mutants de Tau en organoïdes cérébraux.
Conditions scientifiques matérielles : Le doctorant ou la doctorante mènera des travaux de biotechnologie des cellules pluripotentes induites, et des analyses par RMN des marquages isotopiques et de la protéine aSyn. Ces travaux seront assistés par des ingénieur(e)s des deux équipes. Tous les équipements de biochimie, biologie cellulaire, analyse RMN sont établis et disponibles. Projet « InOrganoids-NMR » financé par l’ANR, période 2024-2027, collaboration avec Supbiotech (Frank Yates). Salaire conventionnée CNRS : ~2150e bruts/mois.
Valorisation: il s'agit d'un projet de science fondamentale dont les résultat seront publiés dans des journaux à revue par les pairs.

Références:
1- Theillet FX et al. (2016) Structural disorder of monomeric a-synuclein persists in mammalian cells. Nature. 530 : 45-50.
2- Theillet FX (2022) In-Cell Structural Biology by NMR: The Benefits of the Atomic Scale. Chemical Reviews. 122: 9497–9570.
3- Theillet FX et al. (2014) Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins. Chemical Reviews. 6661-6714.
4- Chérot H. et al. (2024) In-cell residue-resolved NMR of micromolar α-synuclein and tau at 310K. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.10.07.617093v1
5- Alik A et al. (2020) Sensitivity-Enhanced 13 C-NMR Spectroscopy for Monitoring Multisite Phosphorylation at Physiological Temperature and pH. Angew Chem 59(26):10411-10415.

Contexte de travail

La thèse sera rattachée à l'école doctorale Médicament, Toxicologie, Chimie, Imageries, (MTCI ED 563). Elle s'effectuera au sein de l'UMR CiTCoM (Cibles Thérapeutiques et Conception de Médicaments) qui rassemble des experts en biologie structurale, en chimie et en toxicologie (~130 personnels permanents et non-permanents). L'UMR est hébergée par l'Université Paris Cité (Faculté de Santé), et est située sur le site de la Faculté de Pharmacie, 4 rue de l'Observatoire 75006 PARIS. Elle bénéficie notamment d'équipements et de plate-formes/plateaux techniques pour la biologie structurale (incubateurs, installation L1-L2 instruments de purification, RMN 600 MHz, robot de cristallisation, cryo-EM 200 keV acquis à installer), et d'accès à des équipements de pointe sur des plate-formes nationales (RMN 950-1200 MHz INFRANALYTICS, Institut Pasteur pour biophysique des macromolécules).
Le doctorant ou la doctorante sera intégré(e) à l'équipe "Etudes structurales et fonctionnelles de nouvelles cibles thérapeutiques", sa thèse sera sous la direction du chef d'équipe FX Theillet. FXT est spécialiste en biochimie, RMN et biologie cellulaire. L'équipe comprend 4 structuralistes/spectroscopistes (1 CRHC, 1 IR, 1 IE, 1 MCF) en plus du chef d'équipe, qui assure les activités de biologie cellulaire avec 1 ingénieur en cours de recrutement. Les ingénieurs actuels sont spectroscopistes et assurent le bon fonctionnement du plateau technique RMN de l'UMR. Le travail de biologie cellulaire est effectué en collaboration avec le laboratoire CellTechs (SupBiotech / CEA-SEPIA, dir. F. Yates) localisé à Fontenay-aux-Roses.

Contraintes et risques

Contraintes de présence physique liée aux activités expérimentales.
Risques magnétique et chimique.
Le doctorant ou la doctorante sera amené(e) à travailler au sein du laboratoire CellTechs (CEA Fontenay-aux-Roses, ~1-2 jours par semaine en 1ere année).