Description du sujet de thèse

Contexte scientifique :
La nitration aromatique est une réaction chimique primordiale en synthèse organique. Elle consiste à introduire un groupement nitro (-NO₂) sur un cycle aromatique. Ce processus joue un rôle fondamental dans l'industrie pharmaceutique, qui exploite la nitration pour la synthèse de nombreux principes actifs, tels que les antibiotiques et les analgésiques. Cependant, les procédés classiques de nitration, utilisant des mélanges d'acide nitrique et sulfurique, souffrent de limitations majeures en termes de sélectivité, de sécurité et d'impact environnemental.
Face à ces défis, l'émergence de la biocatalyse comme alternative aux méthodes chimiques traditionnelles représente une avancée prometteuse. L'utilisation d'enzymes nitrantes permettrait d'effectuer des nitrations sous des conditions réactionnelles plus douces, réduisant la formation de sous-produits indésirables et améliorant la sélectivité de la réaction. Cette approche permettrait également d'éliminer l'usage d'acides forts et de solvants toxiques, réduisant ainsi les risques pour la sécurité des opérateurs et l'empreinte écologique du processus, et ce en totale adéquation avec la réglementation européenne REACh.
Notre approche repose sur l'ingénierie enzymatique afin de développer une protéine optimisée pour la synthèse de la 4-nitroaniline, un intermédiaire clé dans l'industrie pharmaceutique. En effet, la 4-nitroaniline est essentielle à la fabrication de médicaments tels que le paracétamol, la dapsone et divers sulfamides antibactériens. Son importance industrielle réside dans la réactivité de ses groupes fonctionnels, permettant une large gamme de transformations chimiques nécessaires à la synthèse de composés complexes.

Objectifs :
L’objectif est de cibler spécifiquement le cytochrome P450 Thaxtomine E (TxtE) issue de la bactérie Streptomyces scabiei, dont la modification par mutagenèse dirigée pourrait permettre la nitration sélective de l’aniline en 4-nitroaniline. Des approches combinées de modélisation computationnelle et de mutagénèse dirigée seront utilisées pour améliorer la stéréosélectivité et l'efficacité catalytique de cette enzyme. Cette stratégie s'inspire de travaux récents ayant démontré l'efficacité de telles méthodes dans l'optimisation d'enzymes pour des transformations chimiques spécifiques, comme la conversion de la lovastatine en pravastatine par le cytochrome P450 CYP105AS1.

Projet de thèse et techniques utilisées :

La thèse s'articulera autour des axes suivants :
(i) Caractérisation structurale et fonctionnelle de l’enzyme TxtE WT, (ii) Design et optimisation in silico de mutants de TxtE, (iii) Validation expérimentale des mutants par tests biochimiques et cristallographie.

• (i) Caractérisation structurale et fonctionnelle de l’enzyme TxtE WT : Afin d’établir une référence structurale et fonctionnelle pour comparer les mutants, l’enzyme WT sera produite, purifiée et caractérisée à l’aide d’une approche combinant biochimie et biophysique. La première étape consistant à optimiser les conditions d’expression et de purification pour obtenir une enzyme homogène et stable, a déjà été réalisé lors d’une étude préliminaire. D’un point de vue fonctionnel, l’enzyme a également été caractérisée à travers des tests de liaison, incluant des essais de fluorescence, afin de quantifier son affinité pour le substrat. Une approche plus complète sera réalisée, incluant les méthodes de calorimétrie isotherme (ITC) et de résonance plasmonique de surface (SPR). Une analyse cinétique complète permettra ensuite de déterminer les constantes Km, kcat et kcat/Km, fournissant ainsi une base de comparaison solide pour évaluer l’effet des mutations introduites lors des étapes suivantes du projet. Sur le plan structural, l’objectif est de déterminer la structure tridimensionnelle de l’enzyme WT par cristallisation et diffraction des rayons X, ce qui permettra d’obtenir une vision détaillée de son site actif et de ses interactions potentielles avec le substrat.

• (ii) Design et optimisation in silico de mutants de TxtE : Nos résultats préliminaires ont permis de concevoir plusieurs mutants grâce à la mise au point d’un pipeline computationnel : des mutants ont été générés par approches stochastiques grâce à l’utilisation de l’algorithme CoulpedMoves du logiciel Rosetta, puis ont été screenés in silico grâce à la réalisation de dynamiques moléculaires permettant l’évaluation de l’affinité entre l’aniline et chacun des mutants (Integration Thermodynamique).

• (iii) Validation expérimentale des mutants par tests biochimiques et cristallographie : Les mutants les plus prometteurs, présentant une affinité et une spécificité améliorées, seront produits puis évalués in vitro par le biais des tests fonctionnels développés dans le point 1 (tests de liaison et d’activité). Les mutants présentant les meilleures affinités et activités enzymatiques seront sélectionnés pour une détermination expérimentale de leur structure.
Cette approche sera itérative et alternera phases in silico (ii) et in vitro (iii) afin de guider l’ingénierie des mutations.

Contexte de travail

Le groupe ECMo du Laboratoire de Biologie tissulaire et Ingénierie Thérapeutique – UMR 5305 CNRS / UCBL est spécialisé dans la modélisation moléculaire de petites molécules, peptides et protéines en milieux complexes. L'équipe est constituée de 5 membres permanents. Le(a) doctorant(e) recruté(e) sera affecté(e) à plein temps à ce groupe et disposera de tous les moyens nécessaires à son travail (station de travail, super calculateur et logiciels de modélisation moléculaire). La partie expérimentale sera réalisée dans le même institut, au sein du laboratoire Molecular Microbiology and Structural Biochemistry - UMR5086 dans l’équipe Résistance aux Médicaments et Protéines Membranaires qui elle vise à caractériser des protéines membranaires et enzymes d'intérêt thérapeutique, en utilisant des approches biophysiques, d'enzymologie, et de biologie structurale (cryo-EM).
Le poste se situe dans un secteur relevant de la protection du potentiel scientifique et technique (PPST), et nécessite donc, conformément à la réglementation, que votre arrivée soit autorisée par l'autorité compétente du MESR.

Le poste se situe dans un secteur relevant de la protection du potentiel scientifique et technique (PPST), et nécessite donc, conformément à la réglementation, que votre arrivée soit autorisée par l'autorité compétente du MESR.

Contraintes et risques

Aucun risque biologique et chimique