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Doctorant (H/F) - Reconstitution in vitro du transport de lipides par la flippase Drs2-Cdc50

Cette offre est disponible dans les langues suivantes :
Français - Anglais

Date Limite Candidature : vendredi 27 mai 2022

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Informations générales

Référence : UMR9198-GUILEN-003
Lieu de travail : SACLAY
Date de publication : vendredi 6 mai 2022
Nom du responsable scientifique : Guillaume Lenoir
Type de contrat : CDD Doctorant/Contrat doctoral
Durée du contrat : 36 mois
Date de début de la thèse : 1 octobre 2022
Quotité de travail : Temps complet
Rémunération : 2 135,00 € brut mensuel

Description du sujet de thèse

Ce projet de thèse s'inscrit dans la compréhension du mécanisme moléculaire du transport de lipides par les flippases, des protéines transmembranaires impliquées dans le maintien de l'asymétrie des lipides dans les membranes cellulaires eucaryotes. Les flippases sont des transporteurs actifs qui couplent le transport de phosphatidylsérine (PS) et phosphatidyléthanolamine (PE) à l'hydrolyse d'ATP, et assurent ainsi le maintien de l'asymétrie en lipides des membranes cellulaires. L'enrichissement de PS sur le feuillet cytosolique des membranes, grâce à l'activité de flippases comme le complexe Drs2-Cdc50, permet le recrutement de protéines régulatrices impliquées dans des processus clés comme le trafic membranaire ou la signalisation cellulaire. Chez l'homme, la mutation de certains résidus des flippases peut conduire à diverses pathologies, par exemple la cholestase intrahépatique. Cette pathologie, qui résulte de mutations du gène ATP8B1, est caractérisée par un déficit de sécrétion des acides biliaires par les cellules hépatiques et une dégénérescence progressive du foie. Il est donc essentiel de comprendre en détail le mécanisme moléculaire du transport de lipides par les flippases.
Nous avons récemment observé que Drs2-Cdc50 était autoinhibée par son extrémité C-terminale et activée par un lipide particulier, le phoshatidylinositol-4-phosphate (PI4P). Par ailleurs, Il a été montré que la petite protéine G Arl1 interagissait avec l'extrémité N-terminale de Drs2 et que la protéine Gea2 interagissait avec l'extrémité C-terminale de Drs2 et que ces deux protéines stimulaient le transport de lipides in vivo. L'objectif de cette thèse consiste à identifier, à l'échelle moléculaire, les mécanismes qui permettent de lever l'autoinhibition de Drs2-Cdc50 par son extrémité C-terminale et l'activation du transport par le PI4P, et de reconstituer in vitro le mécanisme par lequel Arl1 et Gea2 activent le transport de lipides par Drs2-Cdc50. Plus spécifiquement, les objectifs principaux de cette thèse sont les suivants :

1. Mise au point un test de transport de lipides en protéoliposomes, de façon à révéler l'activité de la flippase Drs2-Cdc50.
2. Identification de la séquence de l'extrémité C-terminale de Drs2 qui conduit à son autoinhibition.
3. Expression et purification des partenaires du complexe Drs2-Cdc50, la petite protéine G Arl1 et le facteur d'échange GDP-GTP pour Arf1, Gea2.
4. Assemblage de Arl1 et Gea2 purifiés avec Drs2-Cdc50 reconstitué en protéoliposomes et influence de la formation du complexe sur le transport de lipides par Drs2-Cdc50.

Le transport de lipides par Drs2-Cdc50 est intimement lié à la régulation du trafic vésiculaire entre le TGN et la membrane plasmique et entre le TGN et les endosomes. De plus, la petite protéine G Arl1 contrôle le trafic vésiculaire au niveau du TGN et Gea2 active Arf1, elle-même impliqué dans la régulation du trafic vésiculaire au niveau de l'appareil de Golgi. Par conséquent, nous espérons à travers ce projet contribuer à mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent la formation des vésicules au niveau du TGN. Ce projet contribuera aussi à un objectif à plus long terme, celui d'obtenir la structure du complexe Drs2-Cdc50-Gea2-Arl1 par cryo-microscopie électronique. Enfin, sachant que le mécanisme de régulation de l'activité de la flippase de levure Drs2-Cdc50 est conservé chez certaines flippases humaines, les connaissances acquises au cours de ce projet se révèleront probablement essentielles pour mieux comprendre le fonctionnement des flippase humaines et les conséquences fonctionnelles des mutations qui leur sont associées.


Collaborations envisagées :
Cette thèse est financée dans le cadre d'un projet ANR collaboratif. L'étudiant en thèse sera amené à échanger avec les laboratoires partenaires du projet :
- LBPA, ENS Paris-Saclay, France
- IGF, Université de Montpellier, France
- Université d'Aarhus, Danemark

Conditions scientifiques matérielles et financières du projet de recherche :
Tous les équipements présents au sein du laboratoire et nécessaires à la réalisation de la thèse seront mis à disposition de l'étudiant en thèse. La thèse est financée par un contrat de recherche ANR, qui subviendra non seulement au salaire de l'étudiant mais aussi à la réalisation du projet dans de bonnes conditions matérielles.

Objectifs de valorisation des travaux de recherche du doctorant : diffusion, publication et confidentialité, droit à la propriété intellectuelle... :
Les travaux issus des recherches conduites par le doctorant seront publiés dans des journaux internationaux à comité de lecture. Ces travaux ne font pas l'objet d'une confidentialité particulière. Le doctorant sera par ailleurs stimulé à présenter des travaux à l'occasion de congrès nationaux et internationaux, par communication orale ou par poster.


Références bibliographiques :

Dieudonné T, Herrera SA, Laursen MJ, Lejeune M, Stock C, Slimani K, Jaxel C, Lyons JA, Montigny C, Pomorski TG*, Nissen P*, Lenoir G*, Autoinhibition and regulation by phosphoinositides of ATP8B1, a human lipid flippase associated with intrahepatic cholestatic disorders. eLife 11, e75272 (2022).

G. Lenoir*, J.M. D'Ambrosio, T. Dieudonné, A. Čopič*, Transport pathways that contribute to the cellular distribution of phosphatidylserine. Front Cell Dev Biol 9, 737907 (2021).

M. Timcenko, T. Dieudonné, C. Montigny, T. Boesen, J.A. Lyons, G. Lenoir, P. Nissen, Structural basis of substrate-independent phosphorylation in a P4-ATPase lipid flippase. J Mol Biol 433, 167062 (2021).

M. Timcenko, J.A. Lyons, D. Januliene, J.J. Ulstrup, T. Dieudonné, C. Montigny, M.R. Ash, J.L. Karlsen, T. Boesen, W. Kühlbrandt, G. Lenoir*, A. Moeller*, P. Nissen*, Structure and autoregulation of a P4-ATPase lipid flippase. Nature 571, 366 (2019).

H. Azouaoui, C. Montigny, T. Dieudonné, P. Champeil, A. Jacquot, J.L. Vázquez-Ibar, P. Le Maréchal, J. Ulstrup, M.R. Ash, J.A. Lyons, P. Nissen, G. Lenoir, High phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P)-dependent ATPase activity for the Drs2p-Cdc50p flippase after removal of its N- and C-terminal extensions. J Biol Chem 292, 7954 (2017).

H. Azouaoui, C. Montigny, M.R. Ash, F. Fijalkowski, A. Jacquot, C. Grønberg, R.L. López-Marqués, M.G. Palmgren, M. Garrigos, M. le Maire, P. Decottignies, P. Gourdon, P. Nissen, P. Champeil, G. Lenoir, A high-yield co-expression system for the purification of an intact Drs2p-Cdc50p lipid flippase complex, critically dependent on and stabilized by phosphatidylinositol-4-phosphate. PLoS One 9, e112176 (2014).

P.-C. Tsai, J.-W. Hsu, Y.-W. Liu, K.-Y. Chen, F.-J. S. Lee, Arl1p regulates spatial membrane organization at the trans-Golgi network through interaction with Arf-GEF Gea2p and flippase Drs2p. Proc Natl Acad Sci USA. 110, E668 (2013).

Contexte de travail

Le/la doctorant.e travaillera au Laboratoire des Protéines et des Systèmes Membranaires (LPSM). Le LPSM s'intéresse aux mécanismes moléculaires qui sous-tendent le transport de molécules ou d'ions à travers les membranes cellulaires, par des approches biochimiques, biophysiques et de dynamique moléculaire. Plus spécifiquement, nous étudions la machinerie protéique responsable du maintien de la répartition asymétrique des lipides dans les membranes cellulaires. Le LPSM fait partie de l'Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC), Institut interdisciplinaire organisé en 5 départements scientifiques, ~60 équipes de recherche et 15 plateformes technologiques de haut niveau. L'I2BC est localisé à Gif-sur-Yvette, ~25 km au sud-ouest de Paris, au cœur de l'Université Paris-Saclay. La thèse sera financée dans le cadre d'un contrat obtenu auprès de l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR).

Contraintes et risques

La thèse sera rattachée à l'école doctorale 'Signalisation et Réseaux Intégratifs en Biologie (BIOSIGNE)' de l'Université Paris-Saclay. Le(la) doctorant(e) pourra être éventuellement amené(e) à manipuler des molécules radiomarquées, dans le cadre d'expériences de phosphorylation du transporteur Drs2, dans un environnement sécurisé et dédié. Le LPSM possède une expérience de longue date dans la manipulation des isotopes radioactifs. Le(la) doctorant.e recevra une formation spécifique préalable à l'utilisation de ces isotopes. De courts séjours dans les laboratoires partenaires de ce projet peuvent être envisagés.

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