Description du sujet de thèse

Le mésappariement entre bases de l'ADN se produit lors de la réplication, pendant la recombinaison homologue quand des hétéroduplex sont formés, mais également suite à l'action de composés chimiques mutagènes et par irradiation (1). Alors que la réparation efficace des mésappariements (ou mismatch repair, MMR) protège contre la transmission de ces mutations entre générations, la présence de mésappariements (mismatch ou MM) est également une source de diversification des organismes et de l'adaptation et de la spéciation des populations microbiennes.
Dans le cas de la formation des MM pendant la recombinaison, ce sont les systèmes MMR des organismes qui empêchent la recombinaison entre deux séquences non identiques, formant ainsi la barrière génétique inter-espèces (2). Alors que les systèmes MMR canoniques et leurs acteurs moléculaires MutSL sont largement étudiés, de nombreux génomes de bactéries et archées ne contiennent pas ces gènes. Au sein de ces microorganismes, une nouvelle voie de réparation de ces MM a été récemment découverte chez les archées et les actinobactéries et dont la protéine NucS/EndoMS est emblématique. L'objectif de ce projet multidisciplinaire est d'étudier les mécanismes et la fonction de cette nouvelle voie de réparation des mésappariements (MMR).
Cette nouvelle voie de réparation utilise l'activité endonucléase des protéines NucS/EndoMS pour créer une cassure de l'ADNdb autour des mésappariements (3). Le présent projet vise à étudier l'arrangement structural des complexes protéines-ADN impliquant les acteurs moléculaires de ces processus de réparation originaux. Les protéines recombinantes seront produites dans Escherichia coli et purifiées par des méthodes chromatographiques. Par la suite, des méthodes structurales complémentaires, tels que la diffusion aux petits angles, la cristallographie et la cryo-microscopie électronique, seront appliqués pour étudier les complexes en solution et dans le cristal. La production et purification des acteurs protéiques (NucS et PCNA) du système de réparation est maitrisé chez Pyrococcus abyssi, et nous criblerons différents substrats "DNA mismatch" (ou MM), branché ou non, pour ainsi identifier la longueur de l'ADN et la stoechiométrie des acteurs qui mène à la formation du complexe de réparation. Ces études structurales s'inscrivent dans un projet ANR plus large (MMRDNABREAK), combinant la biochimie, la génétique et la biologie structurale pour comprendre plus en détails comment l'information génétique pour réparer les MMs est récupérée, à partir de la matrice intacte par recombinaison homologue, ou par la voie de jonctions des extrémités non homologue, propice à l'introduction d'erreurs. Le projet "MMRDNABREAK" nous permettra de comprendre les principales différences entre ces deux voies de réparation, permettant de détecter et de corriger les mésappariements, dont l'introduction est fréquente lors de la réplication ou la recombinaison de l'ADN. Étant donné que ces voies de réparation sont uniquement présentes chez les archées et actinobactéries, les acteurs protéiques étudiés ici peuvent représenter de nouvelles cibles d'inhibition dans la recherche de voies alternatives antibactériennes, ou encore représenter des nouvelles outils en biotechnologie pour l'ingénierie de l'ADN.
La ou le candidat.e aura comme activité de produire et purifier les protéines et complexes ternaires (NucS-PCNA-MM-DNA) et de conduire les analyses biophysiques nécessaire pour la caractérisation et l'analyse structurale des mêmes complexes. Ces activités peuvent inclure la cristallographie des protéines les analyses SAXS et/ou la cryo-EM.
1. Kunkel, T.A. and Erie, D.A. (2015) Annu Rev Genet, 49, 291-313
2. Spies, M. and Fishel, R. (2015) Cold Spring Harb Perspect Biol, 7, a022657.
3. Creze, C., Ligabue, A., Laurent, S., Lestini, R., Laptenok, S.P., Khun, J., Vos, M.H., Czjzek, M., Myllykallio, H. and Flament, D. (2012). J Biol Chem, 287, 15648-15660.

Contexte de travail

Ce contrat doctoral est co-financé par le projet ANR_MMRDNABREAK, coordonné par Dr. Hannu Myllykallio à l'école Polytechnique Paris, et la Région Bretagne (programme ARED 2023), et s'inscrit dans l'activité collaborative entre trois laboratoires : le Laboratoire d'optiques et biosciences, CNRS UMR 7645-INSERM-Ecole Polytechnique, le laboratoire LM2E, UMR 6197/IFREMER/UBO/CNRS) et la Station Biologique de Roscoff, LBI2M, UMR8227 Sorbonne Université CNRS. Le contrat s'effectuera principalement dans le laboratoire CNRS LBI2M, partenaire de l'ANR, et plus précisément dans l'équipe Glycobiologie Marine de l'UMR8227, et sur la plateforme de cristallographie de la Station Biologique de Roscoff. Des séjours de quelques/plusieurs mois, au LM2E pour la biochimie des protéines, et à l'école Polytechnique pour des études par cryo-microscopie électronique, seront également au programme. L'institut d'accueil, la Station Biologique de Roscoff, est un centre de recherche en biologie marine et océanologie situé dans la ville de Roscoff sur la magnifique côte nord de la Bretagne. Au sein du Laboratoire de Biologie Intégrative des Modèles Marins (LBI2M), l'équipe Glycobiologie Marine s'intéresse de façon générale aux relations structure-fonction d'enzymes actives sur les polysaccharides marins. Le projet inclut la résolution de structures cristallographiques au synchrotron SOLEIL à St Auban, où des déplacements de courte durée sont possibles.

Contraintes et risques

Contraintes liées à la manipulation en laboratoire de biochimie, biologie structurale et biologie moléculaire.

Informations complémentaires

Le/la candidat-e sera titulaire d'un master en biochimie et biologie structurale des protéines.
Le/la candidat-e s aura des connaissances approfondis d'au moins une méthode en biologie structurale, ainsi que de la production et purification hétérologue de protéines. La connaissance des mécanismes moléculaires des voies de réparation de l'ADN sera un plus. Par ailleurs, le/la candidat.e aura la capacité à formuler et conduire un projet scientifique, la capacité à communiquer et valoriser les travaux, la maîtrise de l'anglais (lu, écrit, parlé) et l'aptitude à travailler en équipe.