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Doctorant H/F : Mécanismes de reprogrammation des gènes bactériens par les petits ARN de plantes

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Informations générales

Référence : UMR8197-NATBOI-025
Lieu de travail : PARIS 05
Date de publication : mercredi 11 septembre 2019
Nom du responsable scientifique : Lionel Navarro
Type de contrat : CDD Doctorant/Contrat doctoral
Durée du contrat : 36 mois
Date de début de la thèse : 15 octobre 2019
Quotité de travail : Temps complet
Rémunération : 2 135,00 € brut mensuel

Description du sujet de thèse

Le RNA silencing est un mécanisme de défense majeur mis en place notamment par les plantes pour limiter la réplication de divers agents pathogènes. Ce mécanisme dépend de la synthèse de petits ARN à partir d'ARN double brin produits au cours de l'infection virale ou de manière endogène par les cellules eucaryotes via notamment la transcription de précurseurs de microARN (miARN). A ce jour, plusieurs miARN ont été caractérisés dans le contrôle de la réponse immunitaire des plantes et orchestrent la résistance aux agents pathogènes telle que Pseudomonas syringae pv. tomato souche DC3000 (Pto DC3000), responsable de la moucheture bactérienne de la tomate. Par exemple, nous avons pu démontrer que la voie miARN de la plante modèle Arabidopsis thaliana jouait un rôle majeur dans l'immunité basale dirigée contre Pto DC3000. Plus récemment, nous avons voulu tester si les petits ARN de plantes pourraient, au-delà de leur fonction de régulateurs négatifs de l'expression des gènes de l'hôte, reprogrammer l'expression des gènes de cette bactérie extracellulaire. Cette hypothèse intrigante suggérait que les petits ARN puissent être transportés au travers de la membrane plasmique et la paroi des cellules végétales, qu'ils passent ensuite les membranes externe et interne de cette bactérie Gram négatif, et enfin, qu'ils dirigent l'extinction de gènes dans des cellules procaryotes qui ne possèdent pas de facteur de RNA silencing canonique. Afin de tester cette hypothèse nous avons généré des lignées transgéniques stables d'Arabidopsis exprimant de manière constitutive des petits ARN ayant des homologies de séquence à deux facteurs de virulence majeurs de Pto DC3000. Nous avons démontré que ces petits ARN artificiels de plantes pouvaient réprimer l'expression de ces gènes bactériens au cours de l'infection. Par ailleurs, nous avons montré que ce phénotype moléculaire était associé à une diminution significative de la pathogénicité bactérienne. Cette régulation génique n'était pas spécifique à Pto DC3000 puisque nous avons également pu démontrer que l'expression chez Arabidopsis de petits ARN contre des gènes de virulence de la bactérie Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) réduisait également l'infection induite par ce pathogène naturel d'Arabidopsis. Par ailleurs, nous avons découvert qu'il était possible d'induire l'extinction de l'expression de gènes bactériens dans des conditions in vitro, c'est à dire en incubant des cellules de Pto DC3000 dans un milieu de culture contenant les petits ARN antibactériens. Finalement, nous avons démontré que la pulvérisation de petits ARN antibactériens sur des plantes sauvages d'Arabidopsis et de tomate pouvaient les protéger contre Pto DC3000, ce qui implique que ces molécules doivent être assimilées et actives dans ces cellules procaryotes.

Bien que nous ayons découvert un tout nouveau mode de régulation de l'expression des gènes bactériens par des petits ARN de plantes, nous ne connaissons par les mécanismes impliqués dans le « Antibacterial Gene Silencing » ou AGS. D'autre part, nous ne savons pas si cette régulation génique pourrait être dirigée par les petits ARN produits naturellement par les plantes hôtes. L'objectif du projet du thèse vise d'une part à identifier les facteurs bactériens impliqués dans l'assimilation des petits ARN antibactériens par Pto DC3000 et Xcc et/ou leur activité dans ces cellules bactériennes. Nous caractériserons ensuite certains de ces gènes en nous focalisant tout particulièrement sur ceux qui régulent négativement ces processus. L'impact de ces mutations sur la reprogrammation des génomes de Pto DC3000 et de Xcc sera ensuite étudié et permettra d'identifier l'ensemble des gènes de ces bactéries ciblés par les petits ARN endogènes de plantes.
Une approche de Tn-seq sera tout d'abord utilisée et nous permettra d'identifier de manière non biaisée les facteurs de Pto DC3000 et de Xcc impliqués dans le AGS. Après validation de ces mutants, l'étudiant(e) les caractérisera dans leur capacité à assimiler des petits ARN ainsi qu'à altérer la reprogrammation de l'expression des gènes bactériens dirigée par petits ARN. Il/Elle sélectionnera ensuite deux ou trois facteurs capables de faciliter l'assimilation et ou l'activité des petits ARN et réalisera des analyses mécanistiques plus fines pour les caractériser dans le processing, la dégradation et/ou l'inhibition traductionnelle médiée par petits ARN. Des approches génomiques de type RNA-seq et pRNA-seq seront également menées à partir de souches bactériennes sauvages et mutantes de Pto DC3000 et de Xcc en contexte d'infections. Cette dernière analyse nous permettra d'identifier l'ensemble des gènes de ces bactéries ciblés par les petits ARN de plantes en condition physiologique d'infection.

Contexte de travail

Les travaux de thèse seront menés dans l'équipe de Lionel Navarro basée à l'Institut de Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS) et sous la supervision de Lionel Navarro. L'approche de Tn-seq sera réalisée en collaboration avec Jennifer Lewis (UC Berkeley) et Laurent Noël (LIPM, Toulouse). l'étudiant(e) aura accès à toutes les plateformes technologiques de l'IBENS et bénéficiera d'un environnement intellectuel très stimulant. Il / elle échangera quotidiennement avec des étudiants, ingénieurs/techniciens et chercheurs de différentes nationalités.

Informations complémentaires

Une bonne maîtrise des techniques de microbiologie et de biologie moléculaire est requise.

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