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Doctorant H/F : Modélisation in vitro par organoïde musculaire sur puce des processus de récupération d'une lésion musculaire chez le sportif

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Informations générales

Référence : UMR5221-PASETI-001
Lieu de travail : MONTPELLIER
Date de publication : mercredi 24 juin 2020
Nom du responsable scientifique : Pascal ETIENNE
Type de contrat : CDD Doctorant/Contrat doctoral
Durée du contrat : 36 mois
Date de début de la thèse : 1 octobre 2020
Quotité de travail : Temps complet
Rémunération : 2 135,00 € brut mensuel

Description du sujet de thèse

Contexte théorique :

Il existe chez l'Homme, au niveau musculaire, une grande variabilité interindividuelle en réponse à un même stress mécanique. Cette variabilité phénotypique est multifactorielle, influencée par des facteurs environnementaux ainsi que par de multiples variants génétiques. Ainsi, pour un même niveau de lésion musculaire, deux sujets de même caractéristique anthropométrique, de même âge, avec les mêmes antécédents médicaux et le même niveau d'activité physique, vont montrer un niveau très variable de régénération musculaire sous tendu par la fonction biologique des cellules souches et leur microenvironnement. Face à un même entrainement, certains sportifs peuvent développer une pathologie musculaire avec des lésions itératives et des déficits de réparation plus invalidante que d'autres sans que le substratum de cette plus grande susceptibilité soit connu.
Plusieurs travaux récents ont mis en évidence la présence de modifications du génome liées à l'environnement et qui pouvaient se transmettre de façon intergénérationnelle. Ce résultat peut expliquer la variabilité interindividuelle vis à vis de la fonction biologique des cellules souches musculaires impliquées dans la régulation de la masse musculaire et de sa fonction [Papadimitriou I.D. & al., BMC Genomics (2016) 17:285], [Petrella J.K., J Appl Physiol (2008) 104:1736]. Ainsi, ces évènements épigénétiques qui semblent réguler l'adaptation du muscle à un stress mécanique, restent encore mal connus, du fait du faible nombre d'études sur le sujet. En effet, ces études nécessitent une analyse multifactorielle sur des biopsies musculaires provenant de cohortes qui doivent être le plus homogènes possibles, bien caractérisées cliniquement vis à vis de l'adaptation du muscle à un stress mécanique. Cette caractérisation in vivo reste complexe du fait de son manque de reproductibilité et peut être invalidante chez le sportif. La possibilité, à partir d'une simple micro biopsie musculaire, d'isoler les cellules satellites afin de reconstituer un muscle sur un axe longitudinal nous permettra de standardiser l'évaluation de la fonction biologique des cellules satellites qui représentera une mesure précise pour chaque sportif de sa capacité de régénération musculaire.
Ainsi, la stratégie dans l'accompagnement médical de chaque sportif de haut niveau et la réathlétisation pourraient être individualisées à sa capacité de régénération musculaire évaluée sur organoïde musculaire permettant de modéliser sur puce un stress lésionnel.

Objectifs scientifiques/hypothèses/problématiques:

Le premier objectif de cette thèse est de proposer une nouvelle méthode d'évaluation précise et reproductible de la capacité de régénération musculaire intervenant dans la récupération d'une lésion musculaire. Le second objectif est d'évaluer l'impact d'un entrainement sur cette capacité de régénération musculaire. Pour cela nous proposons une nouvelle approche par la modélisation d'un stress mécanique sur un organoïde musculaire créé à partir des cellules souches du sportif.
Le travail du doctorant sera dans un premier temps, à partir des cellules souches, de valider un protocole complet de fabrication de l'organoïde représentatif in vitro de sa capacité de régénération. Dans un deuxième temps, le doctorant devra proposer, à partir de l'organoïde, une méthode reproductible d'évaluation de la fonction biologique des cellules souches, garant de la capacité de régénération musculaire. Cette méthode sera centrée sur l'application d'un stress mécanique excentrique, sur l'organoïde, permettant de modéliser in vitro une lésion musculaire dans le cadre d'un effort intensif. Elle permettra de suivre et d'évaluer en laboratoire, les mécanismes cellulaires mis en place par l'organoïde pour assurer la régénération de ses fibres musculaires.

Verrous scientifiques à lever/enjeux/challenge:

Ce projet doit prendre la suite d'une base de travail très positive effectuée à partir de cellules souches musculaires diaphragmatiques qui ont permis de modéliser in vivo la dysfonction diaphragmatique induite par la ventilation mécanique (DDIV) chez les patients en réanimation. L'utilisation de surfaces biocompatibles et microstructurées en forme de sillons pour y faire différentier et croître linéairement les cellules souches a montré d'excellents résultats (Figure 1). Le premier enjeu consiste à optimiser la croissance pour réussir à réaliser un véritable organoïde musculaire en trois dimensions, représentatif du modèle in-vivo. Plusieurs modèles de microstructuration seront à tester. Un deuxième enjeu réside dans la capacité à mettre en œuvre la sollicitation mécanique dans le cadre de l'application d'un stress excentrique. Une traction directe de l'organoïde étant non envisageable, nous proposons de multiplier et différencier les cellules souches musculaires sur un support souple type silicone et qui pourra être étiré mécaniquement, une fois l'organoïde obtenu. La réussite d'une telle expérience nécessite un lien fort entre l'organoïde et la membrane pour le transfert de l'effort mécanique. L'utilisation classique d'un Matrigel® poreux et peu adhérent a été testée mais n'apparaît pas pertinente. Nous proposons une meilleure stratégie qui consiste à greffer des ligands peptidiques présentant l'avantage d'être biomimétiques mais surtout d'être fixés de façon covalente au silicone. Le dernier enjeu pour cette thèse sera, en regard des microsillons, support des fibres musculaires de notre organoïde, d'insérer des électrodes de stimulation. Celles-ci nous permettront, lors de l'étirement mécanique, d'induire une contraction de l'organoïde, permettant de modéliser un stress excentrique à la base d'une lésion musculaire.

Grandes lignes de la méthodologie qui sera mise en œuvre :

Au titre de la saisonnalité sportive, sous la coordination technique et la supervision du CREPS de Montpellier et de la Fédération Française d'Athlétisme avec le concours des structures sportives Ligue Occitanie du sport universitaire et Montpellier Athletic Méditerranée Métropole, nous définirons une cohorte de 20 athlètes jeunes adultes et 20 athlètes seniors (à parité de genre) qui subiront un programme d'entraînement défini avec des exercices hebdomadaires de force pour augmenter la masse musculaire. Des tests physiques calibrés viendront valider régulièrement l'évolution musculaire des sujets sur la base d'activités communes et identiques. Une micro biopsie musculaire des quadriceps et un prélèvement sanguin seront réalisés en début et fin de programme d'entraînement. Le prélèvement sanguin s'inscrit dans une perspective des futurs travaux qui découleront de cette thèse. Il permettra ultérieurement d'évaluer si une signature épigénétique prédictive de la réponse musculaire à un phénomène lésionnel pourrait être également retrouvée au niveau des cellules sanguines. En effet, cette étude, complémentaire à ce sujet de thèse, met en jeu l'hypothèse d'une origine épigénétique sur la résistance et la capacité de régénération musculaire de l'athlète. Elle devrait être menée par l'équipe, Génome et Plasticité Cellulaire dans le Développement et le Vieillissement, dirigée par Jean-Marc Lemaître (IRBM).
Les cellules souches issues de ces athlètes constitueront la base de construction de l'organoïde. Nous prévoyons de cultiver et différentier les cellules satellites sur un support selon un axe longitudinal unique similaire à un environnement in vivo. Pour ce faire, nous allons utiliser une méthode de prototypage rapide pour imprimer des sillons de guidage avec un matériau hybride biocompatible sur un support silicone. Les sillons forceront l'alignement des fibres musculaires le long d'un seul axe grâce au principe de contact, reproduisant l'organisation physiologique d'un muscle. De plus, pour induire une contraction excentrique, l'organoïde sera construit sur membrane de silicone souple étirable dans laquelle, en regard de chaque microsillon aura été intégré une microélectrode de stimulation. Bien que biocompatible, le support en silicone est bio-inerte. Pour garantir l'adhésion des fibres musculaires de l'organoïde qui devra résister aux contraintes mécaniques induites par la contraction excentrique, le silicone sera fonctionnalisé. La stratégie proposée par l'équipe peptides et protéines de Gilles Subra (IBMM) consistera à greffer de manière covalente sur la surface de silicone des ligands peptidiques pertinents dérivés de protéines d'adhésion de matrices extracellulaires [Pinese C. & al., Materials Today Chemistry (2017) 4:73]. Ensuite, la Plateforme OptoMicrofluidique de Montpellier (POMM) et l'équipe de Pascal Etienne (L2C) apporteront leur expertise sur les matériaux hybrides organiques-inorganiques photostructurables (MHOIP) déjà utilisés pour des applications dans les domaines de l'optique intégrée et de la microfluidique [Yaacoub S. & al., J. of sol-gel sci. & Tech. (2013) 67 (2) 384]. Les MHOIP ont des propriétés ajustables en modifiant la composition chimique et la structure moléculaire. Les microstructures sont obtenues par dépôt du MHOIP suivi de l'action séquentielle d'une irradiation UV localisée à l'aide d'une machine d'écriture laser puis d'une gravure humide des zones exposées ou non exposées selon le type de MHOIP.
Les cellules satellites seront ensuite cultivées sur les microstructures de soutien biocompatibles pour développer un dispositif « muscle-on-a-chip » afin qu'elles puissent proliférer sur un seul axe longitudinal, sous forme de myoblastes et myotubes selon un protocole expérimental décrit et validé par l'unité de Jacques Mercier (PhyMedExp). Une fois l'organoïde obtenu, le challenge sera d'imposer sur celui-ci un stress excentrique. Pour cela, l'organoïde sera, grâce à un dispositif de type Flexcell®, étiré mécaniquement et électriquement stimulé pour induire une contraction musculaire synchronisée.
Nous testerons différents protocoles de contraction excentrique, qui devront permettre d'induire de façon reproductible et standardisée des phénomènes lésionnels stimulant la régénération musculaire. Ainsi l'objectif sera de pouvoir déterminer la puissance d'organogenèse post lésion musculaire des cellules satellites constitutives de l'organoïde en lien avec son microenvironnement. Cette évaluation comprendra la mesure directe du stress oxydant induit par le stress excentrique, l'activation des voies de signalisation homéostatiques des protéines, la capacité des myoblastes à proliférer, les dimensions des myotubes régénérés et les anomalies de fusion.

Résultats attendus :

Un sportif qui possède une faible capacité de régénération musculaire va rentrer dans un cycle de lésion musculaire itérative à minima, limitant ses performances sportives. Ainsi dans les travaux de cette thèse nous nous attendons à trouver une variabilité interindividuelle dans la réponse musculaire au même stress excentrique. Nous nous attendons également à ce que les paramètres d'évaluation de la récupération musculaire évalués in vitro puisse être corrélés avec les performances du sportif.
Les perspectives de ces travaux de thèse sont nombreuses. Ils permettront, pour des futurs travaux d'évaluer la variabilité interindividuelle humaine dans la réponse musculaire au même stress mécanique et d'étudier son lien avec les changements épigénétiques dynamiques propres à chaque sportif. Ainsi ces premiers travaux permettront dans un futur proche d'évaluer si une signature épigénétique prédictive de la réponse musculaire à un phénomène lésionnel pourrait être également retrouvée au niveau des cellules sanguines. Cette perspective ouvrira la voie vers des tests sanguins permettant de différencier de façon prédictive les sportifs susceptibles de développer plus que d'autres des lésions musculaires itératives nécessitant des modalités et une adaptation de leur intensité d'entraînement. Enfin, cet outil développé au cours de cette thèse permettra de tester in vitro chez l'homme, des biomolécules actives sur la fonction biologique des cellules souches et sur la régénération musculaire.

Contexte de travail

Le doctorant sera inscrit à l'école doctorale Information, Structures et Systèmes (I2S, www.edi2s.univ-montp2.fr).
Il sera affecté au Laboratoire Charles Coulomb (www.coulomb.umontpellier.fr) au sein de l'Equipe "Matériaux Hybrides et Nanostructures" et réalisera une partie de son travail au sein de POMM, la plateforme OptoMicrofluidique de Montpellier (www.pomm.cnrs.fr). Il y fabriquera toutes les microstructures support à la croissance des organoïdes. Le doctorant étudiera et concevra également les outils expérimentaux mis en place dans le cadre des mesures mécaniques sur les organoïdes.
De par l'aspect transdisciplinaire du projet, le doctorant aura à interagir avec plusieurs autres équipes du site MUSE.
En particulier, le doctorant devra collaborer l'équipe Aminoacides et Peptides de l'Institut des Biomolécules Max Mousseron afin de réaliser la fonctionnalisation des supports de croissance des organoïdes, permettant un meilleur ancrage des fibres musculaires différentiées.
D'autre part, pour tester la capacité des supports dans la genèse d'organoïdes à partir d'une culture de cellules souches, le doctorant sera accueilli au sein de l'unité PhyMedExp (UMR CNRS 9214 – Inserm U1046, CHU Montpellier) de l'Université de Montpellier (www.u1046.edu.umontpellier.fr). Il aura accès à la salle de culture (L2) de l'Unité pour mettre en place le modèle cellulaire musculaire à partir de myotubes humains, ces myotubes étant eux-mêmes issus de cellules souches purifiées à partir de biopsies de muscles squelettiques humains. Les biopsies nécessaires à la réalisation de ce projet de recherche s'effectueront dans le service de chirurgie thoracique de l'hôpital Arnaud de Villeneuve, CHU de Montpellier. Ce protocole a déjà été validé en juillet 2016 par les différents organismes compétents (CPP Sud Méditerranée I :RO–2016/30).
Enfin, Le doctorant devra également entretenir une relation étroite et permanente avec les partenaires du mouvement sportif (MA2M et FFSU Occitanie) chargés d'initier et d'animer des cohortes sous la supervision complémentaire du référent scientifique du Département de la Performance Sportive du CREPS de Montpellier. Cette relation sera administrative et technique (calendrier des opérations, constitution des cohortes, établissement et mise en œuvre des protocoles d'entraînement, prélèvements biologiques et retours sur expériences)
L'étudiant aura accès à toutes les ressources instrumentales disponibles au sein de ces structures et à travers les diverses plateformes de l'Université de Montpellier.

Contraintes et risques

Le doctorant sera le lien entre les nombreux partenaires. Il devra donc disposer d'un grand sens de l'organisation et d'une bonne autonomie pour gérer au mieux les interactions et faire preuve d'une maturité dans la planification de ses travaux en interface avec les différents laboratoires impliqués.
D'un point de vue expérimental, le doctorant manipulera des réactifs chimiques pour ses synthèses et du matériel biologique pour la préparation des organoïdes. Il sera donc amené à travailler dans des salles à accès contrôlé et nécessitant le port d'équipements de sécurité spécifiques.
Bien que toutes les études doivent se faire sur Montpellier, le doctorant pourra être amené, si nécessaire, à développer des collaborations avec d'autres partenaires français ou européens. Des déplacements sont donc à prévoir. Le doctorant devra également présenter ses travaux dans des congrès nationaux ou internationaux au moins une fois par an et assurer une bonne diffusion de son travail au sein de la communauté scientifique locale.

Informations complémentaires

Le profil recherché est prioritairement un expérimentateur de type biochimiste avec un cursus montrant une ouverture à la science des matériaux. Un profil de biologiste est aussi envisageable à la condition qu'il montre une motivation vers la chimie et la science des matériaux.
Connaissance de la culture cellulaire et de la physiologie musculaire à travers soit l'enseignement, soit les stages effectués.
Très forte autonomie et sens de l'organisation
Maitrise de la gestion de projet
Bonnes capacités expérimentales (démontrées lors des stages)

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